酶聯(lián)免疫法基本原理及注意事項

　　這類(lèi)反應的定性結果可以用肉眼判斷。目視標本也無(wú)色或近于無(wú)色者判為陰性，顯色清晰者為陽(yáng)性。但在ELSIA試劑盒中，正常人血清反應后?？沙霈F呈色的本底，此本底的深淺因elisa試劑盒的組成和實(shí)驗的條件不同而異，因此實(shí)驗中必須加測陰性對照。陰性對照的組成應為不含受檢物的正常血清或類(lèi)似物(見(jiàn)3.6)。在用肉眼判斷結果時(shí)，更宜用顯色深于陰性對照作為標本陽(yáng)性的指標。此時(shí)酶催化無(wú)色的底物生成有色的產(chǎn)物。反應的溫度和時(shí)間仍是影響顯色的因素。在一定時(shí)間內，陰性孔可保持無(wú)色，而陽(yáng)性孔則隨時(shí)間的延長(cháng)而呈色加強。適當提高溫度有助于加速顯色進(jìn)行。在定量測定中，加入底物后的反應溫度和時(shí)間應按規定力求準確。ELISA試劑盒定性測定的顯色可在室溫進(jìn)行，時(shí)間一般不需要嚴格控制，有時(shí)可根據陽(yáng)性對照孔和陰性對照孔的顯**況適當縮短或延長(cháng)反應時(shí)間，及時(shí)判斷。

　　OPD底物顯色一般在室外溫或37℃反應20-30分鐘后即不再加深，再延長(cháng)反應時(shí)間，可使本底值增高。OPD底物液受光照會(huì )自行變色，顯色反應結束時(shí)加入終止液終止反應。OPD產(chǎn)物用硫酸終止后，顯色由橙黃色轉向棕黃色。

　　TMB受光照的影響不大，可在室溫中置于操作臺上，邊反應觀(guān)察結果。但為保證實(shí)驗結果的穩定性，宜在規定的適當時(shí)間閱讀結果。TMB經(jīng)HRP作用后ELISA試劑盒，約40分鐘顯色達，隨即逐漸減弱，ELISA試劑盒至2小時(shí)后即可*消退至無(wú)色。TMB的終止液有多種，疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉(SDS)等酶抑制劑均可使反應終止。這類(lèi)終止劑尚能使藍色維持較長(cháng)時(shí)間(12-24小時(shí))不褪，是目視判斷的良好終止劑。此外，各類(lèi)酸性終止液則會(huì )使藍色轉變成黃色，此時(shí)可用特定的波長(cháng)(450nm)測讀吸光值。

　?、偈箍乖蚩贵w結合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。

　?、谑箍乖蚩贵w與某種酶連接成酶標抗原或抗體，這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測定時(shí)，把受檢標本(測定其中的抗體或抗原)和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與其他物質(zhì)分開(kāi)，結合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據顏色反應的深淺來(lái)進(jìn)行定性或定量分析。由于酶的催化頻率很高，故可地放大反應效果，從而使測定方法達到很高的敏感度。

　　BUNSEN本生ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。在這種測定方法中有3種必要的試劑：

　?、俟滔嗟目乖蚩贵w

　?、诿笜擞浀目乖蚩贵w

　?、勖缸饔玫牡孜?。根據試劑的來(lái)源和標本的性狀以及檢測的具備條件，可設計出各種不同類(lèi)型的檢測方法。

　　BUNSEN本酶聯(lián)免疫法注意事項：

　?、闭皆囼灂r(shí)，應分別以陽(yáng)性對照與陰性對照控制試驗條件，待檢樣品應作一式二份，以保證實(shí)驗結果的準確性。有時(shí)本底較高，說(shuō)明有非特異性反應，可采用羊血清、兔血清或BSA等封閉。

　?、苍贓LISA中，進(jìn)行各項實(shí)驗條件的選擇是很重要的，其中包括：

　?、殴滔噍d體的選擇：許多物質(zhì)可作為固相載體，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。當前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何種載體，在使用前均可進(jìn)行篩選：用等量抗原包被，在同一實(shí)驗條件下進(jìn)行反應，觀(guān)察其顯色反應是否均一性，據此判明其吸附性能是否良好。

　?、瓢豢贵w(或抗原)的選擇：將抗體(或抗原)吸附在固相載體表面時(shí)，要求純度要好，吸附時(shí)一般要求PH在9.0～9.6之間。吸附溫度，時(shí)間及其蛋白量也有一定影響，一般多采用4℃18～24小時(shí)。蛋白質(zhì)包被的適濃度需進(jìn)行滴定：即用不同的蛋白質(zhì)濃度(0.1、1.0和10μg/ml等)進(jìn)行包被后，在其它試驗條件相同時(shí)，觀(guān)察陽(yáng)性標本的OD值。選擇OD值而蛋白量少的濃度。對于多數蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)通常為1～10μg/ml。

　?、敲笜擞浛贵w工作濃度的選擇：首先用直接ELISA法進(jìn)行初步效價(jià)的滴定(見(jiàn)酶標記抗體部份)。然后再固定其它條件或采取“方陣法"(包被物、待檢樣品的參考品及酶標記抗體分別為不同的稀釋度)在正式實(shí)驗系統里準確地滴定其工作濃度。

　?、让傅牡孜锛肮潴w的選擇：對供氫體的選擇要求是價(jià)廉、安全、有明顯地顯色反應，而本身無(wú)色。有些供氫體(如OPD等)有潛在的致癌作用，應注意防護。有條件者應使用不致癌、靈敏度高的供氫體，如TMB和ABTS是當前較為滿(mǎn)意的供氫體。底物作用一段時(shí)間后，應加入強酸或強堿以終止反應。通常底物作用時(shí)間，以10-30分鐘為宜。底物使用液必須新鮮配制，尤其是H2O2在臨用前加入。

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