PCR試劑盒實(shí)驗的注意事項

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　　PCR實(shí)驗要注意以下幾點(diǎn)：

　　1. PCR引物設計：

　　引物設計可能是PCR擴增成功zui關(guān)鍵的因素。如引物設計欠佳，可能導致擴增產(chǎn)物不足，甚至擴增失敗，其原因是設計欠佳的引物可導致非特異擴增和/或形成引物二聚體，此又成為PCR反應的競爭性產(chǎn)物，從而進(jìn)一步抑制PCR產(chǎn)物形成。

　　在引物設計時(shí)必須考慮以下幾個(gè)因素，其中zui重要的是引物長(cháng)度、溶解溫度(Tm)、特異性、引物序列互補問(wèn)題、G/C 含量和多嘧啶(T,C) 或多嘌呤(A, G)延伸、3’-末端序列等。

　　(1)引物長(cháng)度：由于PCR反應的特異性、退火溫度以及時(shí)間均至少部分與PCR引物長(cháng)度相關(guān)聯(lián)，因此引物長(cháng)度是PCR擴增是否成功關(guān)鍵的因素。一般PCR引物長(cháng)度為15-30核苷酸。

　　(2)溶解溫度(Tm)：因加熱而斷開(kāi)H鍵，使雙鏈DNA分開(kāi)或“溶解"為單鏈DNA。溶解溫度(Tm)即指使一半雙鏈DNA變?yōu)閱捂淒NA的溫度。Tm可采用下列公式計算：Tm=2(A+T) + 4(G+C)。

　　需注意PCR反應至少有兩個(gè)(一對)引物，兩個(gè)寡核苷酸引物Tm 值應比較接近，不可差異過(guò)大。因有較高的Tm值的引物在較低的反應溫度時(shí)可發(fā)生錯配，而引物Tm值較低，反應溫度較高時(shí)則可能不能發(fā)生作用，因此如引物的Tm值差異較大，可導致PCR擴增效率低下甚至擴增失敗。

　　(3)引物序列互補：設計引物時(shí)應沒(méi)有3個(gè)堿基以上的內引物配對，如引物有這樣具有自我配對的區域，“彈回"即部分雙鏈結構將發(fā)生在退火反應時(shí)。

　　(4)G/C 含量和多嘧啶(T,C) 或多嘌呤(A, G)延伸：待選擇的引物序列應盡可能是堿基隨意分布，G+C含量平均-避免長(cháng)A+T和富含G+C的區域。在引物的堿基組成中GC含量一般為45%-55%。在選擇的引物序列中應沒(méi)有多G 或多C延伸，因其可促進(jìn)非特異性退火，多A 和多T延伸也應避免，因其可“呼吸"和使引物-模板復合物展開(kāi)延伸，降低擴增的效率。同時(shí)多嘧啶(T,C)和多嘌呤(A,G)延伸也應被避免。

　　(5)3’-末端序列：為控制引物錯配，應認真地確定PCR引物中3’末端的位置。

　　總而言之，應重視PCR引物設計，設計PCR引物時(shí)應認真小心。對于一個(gè)成功的PCR來(lái)說(shuō)，幾個(gè)重要因素如引物長(cháng)度、GC含量和3’序列必須優(yōu)化。理想的引物應為差不多隨意分布的核苷酸混合、GC含量50%、長(cháng)度約為20個(gè)堿基，因此能使Tm值處于56-62oC范圍。分析靶基因潛在引物位點(diǎn)時(shí)，應考慮無(wú)單聚合體, 沒(méi)有明顯的二級結構形成的傾向，不自我互補，與其他雙鏈靶基因序列沒(méi)有明顯的同源性。為避免枯燥無(wú)味的設計，節省時(shí)間，減少錯誤，可應用計算機程序優(yōu)化設計、選擇、確定寡核苷酸引物。

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