細胞凍存的過(guò)程中的注意事項

　　細胞培養的傳代及日常維持過(guò)程中，在培養器具、培養液及各種準備工作方面都需大量的耗費，而且細胞一旦離開(kāi)活體開(kāi)始原代培養，它的各種生物特性都將逐漸發(fā)生變化并隨著(zhù)傳代次數的增加和體外環(huán)境條件的變化而不斷有新的變化。因此及時(shí)進(jìn)行細胞凍存十分必要。細胞冷凍儲存在-70℃冰箱中可以保存一年之久;細胞儲存在液氮中，溫度達-196℃，理論上儲存時(shí)間是無(wú)限的。下面BUNSEN本生詳述：

　　以下是關(guān)于細胞凍存的注意事項：

　　1. 為保持細胞最大存活率，一般都采用慢凍存融的方法。

　　2. 凍存物距液氮面越近溫度越低。標準的低凍速度為-1℃~12℃/分鐘，當溫度下降達-25℃時(shí)，下降速度可增至-5~-10℃/分鐘，到-100℃時(shí)則可迅速凍入液氮中。因此要適當掌握凍存物下降入液氮中的速度，過(guò)快能影響細胞內水分透出，太慢則促冰晶形成。

　　3. 初次凍存者在下降凍存時(shí)，宜先用細木棒伸入罐中探測液面位置，然后需用溫度計與凍存物并行的辦法，以觀(guān)測下降凍存物的速度、凍存物與液氮液面距離和溫度三者關(guān)系，當已掌握以上各參數和凍存技術(shù)熟練后，僅按下降時(shí)間和下降距離便可獲理想凍存效果。

　　4. 各種細胞對凍存速度的要求也不一樣;上皮細胞和成纖維細胞耐受性可能大些，骨髓干細胞-2~-3℃/分鐘合適;胚胎細胞耐受性較小，不宜太快?？傊谝婚_(kāi)始時(shí)，下降速度不能超過(guò)-10℃/分鐘。

　　5. 用什么防護劑合適和用量多大，要依細胞而定，初代培養細胞用DMSO 較好，一般細胞可用甘油;用量以較小為好。有人認為人皮膚上皮細胞貯存在20%-30%甘油中很好。

　　6. 原則上細胞在液氮中可貯存多年，但為妥善起見(jiàn)，凍存一年后，應再復蘇培養一次，然后再繼續凍存。

　　7. 將凍存管放入液氮容器或從中取出時(shí)，要做好防護工作，以免凍傷

　　8. 注意自身的安全，對于來(lái)自人源性或病毒感染的細胞株應特別小心。操作過(guò)程中，應避免引起氣溶膠的產(chǎn)生，小心有毒性試劑例如DMSO，并避免尖銳物品傷人等。

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