ELISA實(shí)驗要點(diǎn)：ELISA溫育背后，藏著(zhù)那些不一樣的選擇呢

　　在ELISA中一般有兩次抗原抗體反應，即加樣本和加酶結合物后?？乖贵w反應的完成需要有一定的溫度和時(shí)間，這一保溫過(guò)程稱(chēng)為溫育(incubation)，有人稱(chēng)之為孵育。

　　溫育的時(shí)間選擇：

　　溫育這一步是ELISA測定中最容易出現問(wèn)題的步驟。目前市面上的商品化試劑盒的反應溫育時(shí)間一般為30~120分鐘，溫育時(shí)間若不夠，可能會(huì )影響測定下限。

　　ELISA屬固相免疫測定，抗原、抗體的結合只在固相表面上發(fā)生。以抗體包被的夾心法為例，加入板孔中的標本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結合的機會(huì )，只有最貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。這是一個(gè)逐步平衡的過(guò)程，因此需經(jīng)擴散才能達到反應的終點(diǎn)。在其后加入的酶標記抗體與固相抗原的結合也同樣如此。這就是為什么ELISA反應總是需要一定時(shí)間的溫育。

　　在一定溫度范圍內，溫育所需時(shí)間與溫度成反比，即溫度越高，則所需時(shí)間相對較短。

　　溫育的溫度選擇：

　　溫育常采用的溫度有43℃、37℃、室溫和4℃(冰箱溫度)等。37℃是實(shí)驗室中常用的保溫溫度，也是大多數抗原抗體結合的合適溫度。

　　在建立ELISA方法作反應動(dòng)力學(xué)研究時(shí)，兩次抗原抗體反應一般在37℃經(jīng)1-2小時(shí)，產(chǎn)物的生成可達。為加速反應，可提高反應的溫度，有些試驗在43℃進(jìn)行，但不宜采用更高的溫度?？乖贵w反應4℃更為，在放射免疫測定中多使反應在冰箱中過(guò)夜，以形成最多的沉淀。但因所需時(shí)間太長(cháng)，在ELISA中一般不予采用。

　　溫育的保溫選擇：

　　溫育方式常采用溫箱法、微波輻射法和水浴法。其中水浴法能較好解決因受熱不均衡所致的周?chē)着c中央孔結果的吸光度差異(“邊緣效應"即外周孔顯色較中心孔深)?？蓪LISA板置于水浴箱中，板底應貼著(zhù)水面，使溫度迅速平衡，為避免蒸發(fā)，板上應加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔，此時(shí)可讓反應板漂浮在水面上。

　　若用溫箱，ELISA板應放在濕盒內，濕盒要選用傳熱性良好的材料(如金屬等)，在盒底墊濕的紗布，最后將ELISA板放在濕紗布上。濕盒應先放在保溫箱中預溫至規定的溫度，特別是在氣溫較低的時(shí)候更應如此。為避免酶標板底部受水汽或磨損導致的讀數誤差，一般采用鼓風(fēng)恒溫箱保溫，這個(gè)過(guò)程必須在酶標板上方貼封紙，以免蒸發(fā)。

　　無(wú)論是水浴還是濕盒溫育，反應板均不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。室溫溫育的反應，操作時(shí)的室溫應嚴格限制在規定的范圍內，標準室溫溫度是指20-25℃，但具體操作時(shí)可根據說(shuō)明書(shū)的要求控制溫育。

　　室溫溫育時(shí)，ELISA板只要平置于操作臺上即可。應注意溫育的溫度和時(shí)間應按規定力求準確。為保證時(shí)間精確，一個(gè)人一次不宜多于兩塊板同時(shí)操作、測定。

　　關(guān)于溫育，在實(shí)際測定操作中應注意：

　　● 不同的溫育環(huán)境對檢測結果有影響，操作中應嚴格按照說(shuō)明書(shū)控制溫育時(shí)間及溫度，并注意封閉避免邊緣效應。

　　● 為確保各板溫度都能迅速達到平衡，不可將反應板疊加放置，設定的溫度及時(shí)間嚴格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，一般加入待測樣本后使其與固相抗原(抗體)置于37℃環(huán)境下溫育。因為很多恒溫箱的構造，溫度及檢測的溫度并非酶標板溫育溫度，所以使用恒溫箱溫育時(shí)建議將溫度計置于酶標板旁，保證酶標板旁溫度為37℃。

　　● 干育和水溫的影響差異較為明顯，建議使用水溫，注意將固相板放入水中，防止受熱不均勻。

　　● 試劑盒一般設定的反應溫度為 37℃，在這個(gè)溫度下放置 30 分鐘，蒸騰的水分會(huì )許多，對于全部反應體系來(lái)講，各種反應物的濃度會(huì )不斷增加，這么必會(huì )致使反應最終的OD值增加，溫育時(shí)貼封片或加蓋，避免標本或稀釋液蒸發(fā)。

　　● 試劑盒設定的一定溫度下的反應時(shí)間并不是反應的終點(diǎn)，提高反應的溫度，會(huì )加速反應，一樣延長(cháng)時(shí)間會(huì )影響反應，這樣得到的反應程度會(huì )比試劑盒斷定的反應程度深，也會(huì )引起陰性高值或假陽(yáng)性。

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