本生資訊:ELISA試劑盒細胞的裂解方法!

　　細胞裂解是改變細胞通透性和活性的重要實(shí)驗方法。那么，到底要如何裂解細胞呢? 不妨來(lái)看下本生生物的詳述：

　　對于培養細胞樣品：

　　1.融解ripa裂解液，混勻。取適當量的裂解液，在使用前數分鐘內加入pmsf，使pmsf的終濃度為1mm。

　　2.對于貼壁細胞：去除培養液，用pbs、生理鹽水或無(wú)血清培養液洗一遍(如果血清中的蛋白沒(méi)有干擾，可以不洗)。按照6孔板每孔加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。用槍吹打數下，使裂解液和細胞充分接觸。通常裂解液接觸細胞1-2秒后，細胞就會(huì )被裂解。

　　對于懸浮細胞：離心收集細胞，用手指把細胞用力彈散。按照6孔板每孔細胞加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。再用手指輕彈以充分裂解細胞。充分裂解后應沒(méi)有明顯的細胞沉淀。如果細胞量較多，必需分裝成50-100萬(wàn)細胞/管，然后再裂解。

　　3.充分裂解后，10000-14000g離心3-5分鐘，取上清，即可進(jìn)行后續的page、western和免疫沉淀等操作。

　　裂解液用量說(shuō)明：通常6孔板每孔細胞加入150微升裂解液已經(jīng)足夠，但如果細胞密度非常高可以適當加大裂解液的用量到200微升或250微升。

　　對于組織樣品：

　　1.把組織剪切成細小的碎片。

　　2.融解ripa裂解液，混勻。取適當量的裂解液，在使用前數分鐘內加入pmsf，使pmsf的終濃度為1mm。

　　3.按照每20毫克組織加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以適當添加更多的裂解液，如果需要高濃度的蛋白樣品，可以適當減少裂解液的用量。)

　　4.用玻璃勻漿器勻漿，直至充分裂解。

　　5.充分裂解后，10000-14000g離心3-5分鐘，取上清，即可進(jìn)行后續的page、western和免疫沉淀等操作。

　　6.如果組織樣品本身非常細小，可以適當剪切后直接加入裂解液裂解，通過(guò)強烈vortex使樣品裂解充分。然后同樣離心取上清，用于后續實(shí)驗。直接裂解的優(yōu)點(diǎn)是比較方便，不必使用勻漿器，缺點(diǎn)是不如使用勻漿器那樣裂解得比較充分。

　　注：ripa裂解液的裂解產(chǎn)物中經(jīng)常會(huì )出現一小團透明膠狀物，屬正?，F象。該透明膠狀物為含有基因組dna等的復合物。在不檢測和基因組dna結合特別緊密的蛋白的情況下，可以直接離心取上清用于后續實(shí)驗;如果需要檢測和基因組結合特別緊密的蛋白，則可以通過(guò)超聲處理打碎打散該透明膠狀物，隨后離心取上清用于后續實(shí)驗。如果檢測一些常見(jiàn)的轉錄因子，例如nf-kappab、p53等時(shí)，通常不必進(jìn)行超聲處理，就可以檢測到這些轉錄因子。