ELISA實(shí)驗要點(diǎn)：ELISA結果判斷-操作
 

　　ELISA試驗結果的判斷主要根據所做實(shí)驗的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,現一般按S/CO進(jìn)行判斷,其中S為樣品吸光度,CO為K*陰性對照,K值依據所做實(shí)驗有所不同。

　　如果沒(méi)有光度計(酶標儀)靠肉眼判斷,則陰、陽(yáng)性判斷主要靠經(jīng)驗。ELISA常用結果判定方法如下：

　　1、 定性測定

　　定性測定的結果判斷是對受檢標本中是否含有待測抗原或抗體作出"有"或"無(wú)"的簡(jiǎn)單回答，分別用"陽(yáng)性"、"陰性"表示。"陽(yáng)性"表示該標本在該測定系統中有反應。"陰性"則為無(wú)反應。用定性判斷法也可得到半定量結果，即用滴度來(lái)表示反應的強度，其實(shí)質(zhì)仍是一個(gè)定性試驗。在這種半定量測定中，將標本作一系列稀釋后進(jìn)行試驗，呈陽(yáng)性反應的最高稀釋度即為滴度。根據滴度的高低，可以判斷標本反應性的強弱，這比觀(guān)察不稀釋標本呈色的深淺判斷為強陽(yáng)性、弱陽(yáng)性更具定量意義。

　　在間接法和夾心法ELSIA中，陽(yáng)性孔呈色深于陰性孔。在競爭法ELISA中則相反，陰性孔呈色深于陽(yáng)性孔。兩類(lèi)反應的結果判斷方法不同，分述于下。

　　(1) 間接法和夾心法

　　這類(lèi)反應的定性結果可以用肉眼判斷。目視標本也無(wú)色或近于無(wú)色者判為陰性，顯色清晰者為陽(yáng)性。但在ELSIA中，正常人血清反應后?？沙霈F呈色的本底，此本底的深淺因試劑的組成和實(shí)驗的條件不同而異，因此實(shí)驗中必須加測陰性對照。陰性對照的組成應為不含受檢物的正常血清或類(lèi)似物(見(jiàn)3.6)。在用肉眼判斷結果時(shí)，更宜用顯色深于陰性對照作為標本陽(yáng)性的指標。

　　目視法簡(jiǎn)捷明了，但頗具主觀(guān)性。在條件許可下，應該用比色計測定吸光值，這樣可以得到客觀(guān)的數據。先讀出標本(sample，S)、陽(yáng)性對照(P)、和陰性對照(N)的吸光值，然后進(jìn)行計算。計算方法有多種，大致可分為陽(yáng)性判定值法和標本與陰性對照比值法兩類(lèi)。

　　a. 陽(yáng)性判定值

　　陽(yáng)性判定值(cut-off value)一般為陰性對照A值加上一個(gè)特定的常數，以此作為判斷結果陽(yáng)性或陰性的標準。

　　用此法判斷結果要求實(shí)驗條件十分恒定，試劑的制備必須標準化，陽(yáng)性和陰性的對照品應符合一定的規格，須配用精密的儀器，并嚴格按規定操作。陽(yáng)性判定值公式中的常數是在這特定的系統中通過(guò)對大量標本的實(shí)驗檢測而得到的?，F舉某種檢測HBsAg的試劑盒為例。試劑盒中的陰性對照品為不含HBsAg的復鈣人血漿，陽(yáng)性對照品HBsAg的含量標明為P=9±2ng/ml.每次試驗設2個(gè)陽(yáng)性對照和3個(gè)陰性對照。測得A值后，先計算陰性對照A值的平均數(NCX)和陽(yáng)性對照A值的平均數(PCX)，兩個(gè)平均數的差(P-N)必須大于一個(gè)特定的數值(例0.400)，試驗才有效。3個(gè)陰性對照A值均應≥0.5×NCX，并≤1.5×NCX，如其中之一超出此范圍，則棄去，而已另兩個(gè)陰性對照重新計算NCX;如有兩個(gè)陰性對照A值超出以上范圍，則該次實(shí)驗無(wú)效。陽(yáng)性判定值按下式計算： 陽(yáng)性判定值=NCX+0.05 標本A值>陽(yáng)性判定值的為陽(yáng)性，小于陽(yáng)性判定值的為陰性。應注意的是，式中0.05為該試劑盒的常數，只適合于該特定條件下，而不是對各種試劑均可通用。

　　根據以上敘述可以看出，在這種方法中陰性對照和陽(yáng)性對照也起到試驗的質(zhì)控作用，試劑變質(zhì)和操作不當均會(huì )產(chǎn)生"試驗無(wú)效"的后果。

　　b.標本/陰性對照比值

　　在實(shí)驗條件(包括試劑)較難保證恒定的情況下，這種判斷法較為合適。在得出標本(S)和陰性對照(N)的A值后，計算S/N值。也有寫(xiě)作P/N的，這里的P不代表陽(yáng)性(positive)，而是病人(patient)的縮寫(xiě)，不應誤解。為避免混淆，更宜用S/N表示。在早期的間接法ELISA中，有些作者定出S/N為陽(yáng)性標準，現多為各種測定所沿用。實(shí)際上每一測定系統應該用實(shí)驗求出各自的S/N的閾值。更應注意的是，N所代表的陰性對照是不含受檢物質(zhì)的人血清。有的試劑盒中所設陰性對照為不含蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)含量較底的緩沖液，以致反應后產(chǎn)生的本底可能較正常人血清的本底低得多。因此，這類(lèi)試劑盒規，如N<0.05(或其他數值)，則按0.05計算，否則將出現假陽(yáng)性結果。

　　(2)競爭法

　　在競爭法ELISA中，陰性孔呈色深于陽(yáng)性孔。陰性呈色的強度取決于反應中酶結合物的濃度和加入競爭抑制物的量，一般調節陰性對照的吸光度在1.0-1.5之間，此時(shí)反應最為敏感。

　　競爭法ELISA不易用自視判斷結果，因肉眼很難辨別弱陽(yáng)性反應與陰性對照的顯色差異，一般均用比色計測定，讀出S、P和N的吸光值。計算方法主要也有兩種，即陽(yáng)性判定值法和抑制率法。

　　a. 陽(yáng)性判定值法

　　與間接法和夾心法中的陽(yáng)性判定值法基本相同，但在計算公式中引入陽(yáng)性對照A值，現舉某種檢測抗HBc的試劑盒為例。試劑盒中的陰性對照為不含抗HBc的復鈣人血漿，陽(yáng)性對照中抗HBc含量為125±100u/ml.每次試驗設2個(gè)陽(yáng)性對照和3個(gè)陰性對照。測得A值后，先計算陰性對照A值的平均值(NCX)和陽(yáng)性對照A值的平均數(PCX)，兩個(gè)平均數的差(N-P)必須大于一個(gè)特定的數值(例如0.300)，試驗才有效。3個(gè)陰性對照A值均應小于2.000，而且應≥0.5×NCX并≤1.5×NCX，如其中之一超出此范圍，則棄去，而以另2個(gè)陰性對照重新計算×NCX;如有2個(gè)陰性對照A超出以上范圍，則該次實(shí)驗無(wú)效。陽(yáng)性判定值按下式計算：

　　陰性判定值=0.4×NCX+0.6×PCX

　　標本A值≤陽(yáng)性判定值的反應為陽(yáng)性，A>陽(yáng)性判定值的反應為陰性。

　　b. 抑制率法

　　抑制率表示標本在競爭結合中標本對陰性反應顯色的抑制程度，按下式計算：

　　抑制率(%)= (陰性對照A值-標本A值)×100%/陰性對照A值

　　一般規定抑制率≥50%為陽(yáng)性，<50%為陰性。

　　2、定量測定

　　ELSIA操作步驟復雜，影響反應因素較多，特別是固相載體的包被難達到各個(gè)體之間的一致，因此在定量測定中，每批測試均須用一系列不同濃度的參考標準品在相同的條件下制作標準曲線(xiàn)。測定大分子量物質(zhì)的夾心法ELISA，標準曲線(xiàn)的范圍一般較寬，曲線(xiàn)最高點(diǎn)的吸光度可接近2.0，繪制時(shí)常用半對數紙，以檢測物的濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標，將各濃度的值逐點(diǎn)連接，所得曲線(xiàn)一般呈S形，其頭、尾部曲線(xiàn)趨于平坦，中央較呈直線(xiàn)的部分是的檢測區域。

　　測定小分子量物質(zhì)常用競爭法，其標準曲線(xiàn)中吸光度與受檢物質(zhì)的濃度呈負相關(guān)。標準曲線(xiàn)的形狀因試劑盒所用模式的差別而略有不同。ELISA測定的標準曲線(xiàn)示例見(jiàn)圖4-2.注意圖中橫坐標為對數關(guān)系，這更有利于測定系統的表達。

　　新型酶標儀一般帶有自動(dòng)軟件可進(jìn)行定量分析。

　　BUNSEN本生ELISA本生一直視質(zhì)量控制為企業(yè)的生命，追求企業(yè)競爭力的不斷提升。公司在經(jīng)營(yíng)中始終秉承：遵紀守法，嚴于律己，寬仁以待，敢于承擔的企業(yè)精神作為標準，以過(guò)硬的質(zhì)量和優(yōu)良的服務(wù)來(lái)維護和拓展市場(chǎng)，較大限度的滿(mǎn)足客戶(hù)的需求。與客戶(hù)的共贏(yíng)，是我們的發(fā)展目標。本生!您信任的合作伙伴。我們愿與您真誠合作，共創(chuàng )美好的未來(lái)。本生吸頭盒