Elisa要點(diǎn)：ELISA試驗洗板機洗板三個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)

　　優(yōu)化ELISA的重點(diǎn)之一在于洗滌。洗滌步驟可降低未結合抗體所引起的背景信號，從而增加分析的信噪比。每一步之間的洗滌確保只有特異的結合事件被保留，在最后一步產(chǎn)生信號。不充分的洗滌會(huì )導致差異和高背景，從而帶來(lái)不理想的結果。在做ELISA實(shí)驗時(shí)，洗板操作合乎要求，能得到正確、可靠的結果。

　　ELISA試驗過(guò)程中洗板機洗板人為因素少，速度快，條件恒定，但是使用洗板機洗板時(shí)應注意以下三個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)。

　　1、洗滌參數

　　主要的參數是洗滌量。自動(dòng)洗板機會(huì )分配洗滌液。如果你之前遭遇過(guò)高背景，那么不要猶豫，將洗滌量調為高，最好是比包被體積更高。太少的洗滌液會(huì )讓一部分分析表面洗滌不到，從而明顯增加背景。所有反應孔的洗滌量必須相同。

　　ELISA試劑盒的使用手冊中列出包被量。我們建議使用350µl洗滌液進(jìn)行洗滌，以便清潔整個(gè)反應孔的壁。一般來(lái)說(shuō)，洗滌量越高，則孵育步驟殘留的抗體或抗原量就越少。

　　2、洗滌次數

　　影響洗滌效果的主要參數是洗滌循環(huán)的量。當然，洗滌次數越多，背景越低。然而，太多次的洗滌會(huì )降低信號強度，使其難以測定。通常的做法是在每次抗體或抗原孵育后重復洗滌三次。不過(guò)，一般而言，包被平板需要的洗滌次數比用戶(hù)包被的平板要少。對于用戶(hù)包被的ELISA板，必須優(yōu)化洗滌次數。

　　控制洗滌量和洗滌次數的另一種方法是加入過(guò)量的洗滌液。一般來(lái)說(shuō)，96孔板的每個(gè)孔能容納330至460 µl。不過(guò)，有些自動(dòng)化洗板機可設置程序，分配遠遠超出這個(gè)量的洗滌液，比如1 ml。它是如何做到的呢?其實(shí)很簡(jiǎn)單，就是在分液的同時(shí)打開(kāi)吸液功能。換句話(huà)說(shuō)，隨著(zhù)分液器分配更多的液體，抽吸器也將液體吸出。這種技術(shù)能增加洗滌量，但不會(huì )溢出到其他孔中。

　　3、抽 吸

　　還有一些參數會(huì )影響洗滌步驟的效果。這些參數包括吸液高度和吸入位置，這兩者都能調整，以降低背景(殘留量)和差異。

　　殘留液體中包含未結合的抗原或抗體，它們會(huì )增加背景信號。殘留量越小，殘留液體越少，轉移到下一步的干擾液體也就越少。

　　吸液高度會(huì )明顯影響殘留量;如果洗滌吸頭與反應孔底部的距離稍大，那就會(huì )讓殘留量急劇增加。反之，如果洗滌吸頭壓著(zhù)反應孔底部，那么也會(huì )使吸液效率降低，殘留量增加。

　　目前的洗板機一般使用兩種類(lèi)型的洗頭：剛性和浮動(dòng)。浮動(dòng)洗頭中的吸頭可在洗滌過(guò)程中自由上下移動(dòng)，而剛性洗頭則固定在適當的位置。使用剛性洗頭的洗滌操作在優(yōu)化起來(lái)更為復雜，因為你需要非常仔細地調整吸液高度。如果你們實(shí)驗室使用幾種不同的板，那可能會(huì )很耗時(shí)。在使用浮動(dòng)洗頭時(shí)，吸頭會(huì )降到反應孔的底部。調整高度就不是很重要，因此洗頭會(huì )下降到底部。

　　抽吸的位置也對殘留量有著(zhù)重要影響;如果每個(gè)孔只使用一個(gè)抽吸點(diǎn)(這很常見(jiàn)，因為更快)，那么抽吸的位置需要優(yōu)化。最佳的位置取決于洗頭的性狀，但它幾乎不在反應孔的中間，即使這是所有洗頭最常見(jiàn)的默認位置。一般來(lái)說(shuō)，最佳位置在孔中間與孔壁之間的某處。

　　反應孔的形狀也會(huì )影響殘留量。C形底(平底圓角)的微孔板一般會(huì )比那些平底尖角的微孔板殘留量更低。

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