本生帶您分析影響ELISA中非特異性顯色的原因

　　影響ELISA中非特異性顯色的原因很多，如試劑盒特異性、檢驗標本中含酶標記物的干擾物，操作過(guò)程中的問(wèn)題。本文就這一原因作一簡(jiǎn)要分析,以便可以通過(guò)以上措施把非特異顯色降至zui低限度，從而提高檢測的特異性，并得到更準確、可靠的實(shí)驗結果。

　　試劑盒特異性因素

　　1. 固相載體的選擇。ELISA中常用的固相載體有微量滴定板、小珠和小試管三種，以微量滴定板最為常見(jiàn)[1]。它具有良好的吸附性能，孔底透明度高，空白值低，各板之間、同一板各孔之間性能相近。聚苯乙烯ELISA板由于原料的不同和制作工藝的差別，各產(chǎn)品的質(zhì)量差異很大。因此，在選擇試劑盒同時(shí)要對其使用的微孔板型號進(jìn)行認證，評估。

　　2.包被物的純度。在酶聯(lián)免疫測定尤其是間接ELISA中，試劑的特異性取決于使用抗原的純度。目前由于技術(shù)條件的限制，包被用抗原或抗體的純度不可能達到100%，所以有些非特異性顯色不可避免，只能盡可能提高純度，提高特異性。目前使用的包被抗原一般為合成多肽抗原。

　　3.包被抗體的效價(jià)。具有高親和力和高特異性的包被抗體，是決定試劑特異性的重要方面。

　　4 .封閉。是ELISA中重要的一步，目的是封閉固相載體表面尚未被所占據的空隙，減少后續步驟中非特異性蛋白的干擾。

　　檢驗標本中含有酶標記物的干擾物

　　1.內源性干擾物：類(lèi)風(fēng)濕因子(RF)、黃疸等，類(lèi)風(fēng)濕因子是可作用于多種動(dòng)物以及人IgGFc段的自身抗體，多數為IgM類(lèi)，能充當抗原成分與固相及酶標抗體反應，從而呈現非特異性顯色。

　　黃疸血標本中常含有內源性過(guò)氧化物酶，如用辣根過(guò)氧化物酶為標記物，就有可能產(chǎn)生非特異性顯色。

　　2 .外源性干擾物，常常因樣品采集、貯存、處理不當造成如樣品溶血，被細菌污染，標本凝集不全等。溶血標本，紅細胞溶解破裂，釋放出血紅素形成，而血紅素中的鐵卟啉是過(guò)氧化物酶的類(lèi)似物，以HRP為標記的ELISA測定中，溶血標本可能會(huì )增加非特異性顯色。如有細菌污染，菌體中可能含有內源性HRP(辣根過(guò)氧化酶)[2]，有國內報道酶免HAg試劑檢測溶血標本時(shí)可造成假陽(yáng)性[3]。如在冰箱中保存過(guò)久，其中的IgG可發(fā)生聚合，在間接法ELISA中可使本底加深[2]。因此，血標本在采集處理時(shí)應小心，在冰箱中保存不易過(guò)久。

　　標本凝集不全時(shí)，血清中會(huì )殘留部分纖維蛋白原，也易造成假陽(yáng)性。

　　操作過(guò)程中的問(wèn)題造成假陽(yáng)性

　　1.加樣

　　對于間接ELISA標本一般都要進(jìn)行稀釋?zhuān)绻訕硬粶示蜁?huì )造成誤差，尤其當稀釋倍數大時(shí)，很小的絕對誤差，會(huì )導致較大的相對誤差，使陰性(或弱陽(yáng)性)標本呈陽(yáng)性(或陰性)。加樣時(shí)應將所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。目前，大部分血站都已使用全自動(dòng)酶免加樣系統處理標本，可較好地避免以上誤差。

　　2.洗滌

　　在ELISA中正確的洗滌是保證得到可重復結果的關(guān)健一步，應引起操作者重視。無(wú)論是手工操作還是機器操作，得出不正確的結果常與不正確的洗滌有關(guān)，ELISA就是靠洗滌來(lái)達到分離游離和結合的酶標記物的目的。通過(guò)洗滌以消除殘留在板孔中沒(méi)能與固體抗原或抗體結合的物質(zhì)，以及在反應過(guò)程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。

　　3 .溫育

　　每種試劑都有其最佳反應模式，其中溫度和溫育時(shí)間控制是重要因素。因孵育溫度高，反應時(shí)間長(cháng)，會(huì )造成整板本底高，陽(yáng)性率高。溫育一般用濕盒或水浴，反應板不宜疊放，以保證各板溫度都能迅速平衡，為避免蒸發(fā)，板上應加蓋。

　　4.酶標儀判讀

　　作為記錄測定結果的儀器，酶標儀的性能穩定與否，決定結果的可靠度。首先酶標儀應定期進(jìn)行保養，對濾光片要定期校正;其次酶標儀波長(cháng)設置要正確，最好使用雙波長(cháng)，一個(gè)檢測波長(cháng)，一個(gè)參比波長(cháng)，以消除微孔板底部劃痕、不平、指印或液面高度差異造成的光干擾。此外，在用酶標儀讀數時(shí)最好先擦試微孔板底部并壓平板條。由于各種酶標儀性能有所不同，使用中應詳細閱讀說(shuō)明書(shū)

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