BUNSEN 重點(diǎn)講談ELISA試劑盒實(shí)驗檢測方案

　　一、雙抗體夾心法

　　1.測抗原

　?、?將特異性抗體與固相載體聯(lián)結，形成固相抗體。洗滌除去未結合的抗體及雜質(zhì)。

　?、?加受檢標本，保溫反應。標本中的抗原與固相抗體結合，形成固相抗原抗體復合物。洗滌除去其他未結合物質(zhì)。

　?、?加酶標抗體，保溫反應。固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結合。*洗滌未結合的酶標抗體。此時(shí)固相載體上帶有的酶量與標本中受檢抗原的量相關(guān)。

　?、?加底物顯色。固相上的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。

　　2.測抗體

　　反應模式與雙抗體夾心法類(lèi)似。用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶結合物，以檢測相應的抗體。與間接法測抗體的不同之處為以酶標抗原代替酶標抗抗體。此法中受檢標本不需稀釋?zhuān)芍苯佑糜跍y定，因此其敏感度相對高于間接法。乙肝標志物中抗HBs的檢測常采用本法。本法關(guān)鍵在于酶標抗原的制備，應根據抗原結構的不同，尋找合適的標記方法。

　　二、間接法測抗體

　　原理：為利用酶標記的抗抗體以檢測與固相抗原結合的受檢抗體，故稱(chēng)為間接法。

　　操作步驟：

　　1.將特異性抗原與固相載體聯(lián)結，形成固相抗原。洗滌除去未結合的抗原及雜質(zhì)。

　　2.加稀釋的受檢血清，保溫反應。血清中的特異抗體與固相抗原結合，形成固相抗原抗體復合物。經(jīng)洗滌后，固相載體上只留下特異性抗體，血清中的其他成份在洗滌過(guò)程中被洗去。

　　3.加酶標抗抗體，可用酶標抗人Ig以檢測總抗體，但一般多用酶標抗人IgG檢測IgG抗體。固相免疫復合物中的抗體與酶標抗體抗體結合，從而間接地標記上酶。洗滌后，固相載體上的酶量與標本中受檢抗體的量正相關(guān)。

　　4.加底物顯色本法主要用于對病原體抗體的檢測而進(jìn)行傳染病的診斷。

　　優(yōu)點(diǎn)評估：只要變換包被抗原就可利用同一酶標抗抗體建立檢測相應抗體的方法。間接法成功的關(guān)鍵在于抗原的純度。雖然有時(shí)用粗提抗原包被也能取得實(shí)際有效的結果，但應盡可能予以純化，以提高試驗的特異性。

　　三、競爭法

　　1.測抗體

　　當抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去，ELISA試劑盒或不易得到足夠的純化抗原時(shí)，可用此法檢測特異性抗體。其原理為標本中的抗體和一定量的酶標抗體競爭與固相抗原結合。標本中抗體量越多，結合在固相上的酶標抗體愈少，因此陽(yáng)性反應呈色淺于陰性反應。

　　如抗原為高純度的，可直接包被固相。如抗原中會(huì )有干擾物質(zhì)，直接包被不易成功，可采用捕獲包被法，即先包被與固相抗原相應的抗體，然后加入抗原，形成固相抗原。洗滌除去抗原中的雜質(zhì)，然后再加標本和酶標抗體進(jìn)行競爭結合反應。競爭法測抗體有多種模式，可將標本和酶標抗體與固相抗原競爭結合，抗HBc ELISA一般采用此法。另一種模式為將標本與抗原一起加入到固相抗體中進(jìn)行競爭結合，洗滌后再加入酶標抗體，與結合在固相上的抗原反應?？笻Be的檢測一般采用此法。

　　2.競爭法測抗原

　　小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個(gè)以上的位點(diǎn)，因此不能用雙抗體夾心法進(jìn)行測定，可以采用競爭法模式。其原理是標本中的抗原和一定量的酶標抗原競爭與固相抗體結合。標本中抗原量含量愈多，結合在固相上的酶標抗原愈少。

　　四、捕獲包被法測抗體

　　如用抗原包被的間接法直接測定IgM抗體，因標本中一般同時(shí)存在較高濃度的IgG抗體，后者將競爭結合固相抗原而使一部份IgM抗體不能結合到固相上。因此如用抗人IgM作為二抗，間接測定IgM抗體，必須先將標本用A蛋白或抗IgG抗體處理，以除去IgG的干擾。

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