ELISA 實(shí)驗的一些原理總結

　　ELISA  即酶聯(lián)免疫吸附測定，是一類(lèi)常用的免疫酶技術(shù)。主要方法是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，然后利用酶標記(偶聯(lián))的抗體或抗原與之孵育，加入顯色劑顯色，通過(guò)酶標儀測定待測物顏色與標準物顏色的差異，繪制出酶活曲線(xiàn)得出待測物濃度。

　　ELISA 可用于測定抗原，也可用于測定抗體。ELISA 實(shí)驗中有三種必要的試劑：

　?、?固相的抗原或抗體(用于結合到固相載體上)

　?、?標記的抗原或抗體(標記物)

　?、?作用的底物(顯色劑，用于顯色)

　　四種常見(jiàn) ELISA方法

　　1. 直接 ELISA

　　將抗原固定于 ELISA 板上，然后用酶標抗體直檢測抗原。

　　相較于其它類(lèi)型的 ELISA 實(shí)驗，直接 ELISA 實(shí)驗步驟少，檢測速度快，不需要用到二抗，避免了交叉反應，測定結果不容易出錯。但是由于直接  ELISA 的抗原不是特異性固定的，樣本中的靶蛋白及其他雜質(zhì)蛋白都會(huì )與 ELISA 板結合，實(shí)驗背景會(huì )比較高。而且直接 ELISA  每種靶蛋白都需要準備能夠與其特異性結合的一抗，實(shí)驗不太靈活。另外由于沒(méi)有使用二抗，信號沒(méi)有被放大，降低了測定的靈敏度。

　　2. 間接 ELISA

　　先將抗原結合到 ELISA 板上，隨后分兩步進(jìn)行檢測：首先加入檢測抗體與抗原特異性結合，隨后加入酶標二抗檢測并利用底物顯色。

　　與直接 ELISA 相比，間接 ELISA 用到酶標二抗，具有更高的靈敏度，也需要更少的標記抗體，更經(jīng)濟。間接 ELISA  還提供了更大的靈活性，因為不同的一抗能夠與單一標記的二抗一同使用。間接 ELISA  實(shí)驗的缺點(diǎn)是存在交叉反應的可能性(酶標二抗直接與抗原結合)，可能會(huì )增加背景，同時(shí)與直接 ELISA 相比，間接 ELISA  實(shí)驗多了二抗孵育的步驟，實(shí)驗周期延長(cháng)。

　　3. 夾心 ELISA

　　先將捕獲抗體固定于 ELISA 板孔中，然后加入樣品，接著(zhù)加入檢測抗體。如果檢測抗體是酶標抗體，則可稱(chēng)為直接夾心  ELISA;如果檢測抗體不帶有標記，則還需要使用酶標二抗與檢測抗體結合，這種稱(chēng)為間接夾心 ELISA。

　　夾心 ELISA 的靈敏度高，它比直接或間接 ELISA 敏感 2-5 倍;同時(shí)夾心 ELISA  使用兩種特異性抗體與抗原結合，擁有很高的特異性。另外夾心 ELISA 能夠通過(guò)直接或間接的方式進(jìn)行檢測，靈活性較高。夾心 ELISA  的缺點(diǎn)是對配對抗體要求很高，如果沒(méi)有標準化的試劑盒或者已經(jīng)通過(guò)測試的配對抗體，則需要進(jìn)行配對抗體定制并進(jìn)行優(yōu)化，因為降低捕獲抗體與檢測抗體之間的交叉反應是非常重要的。

　　4. 競爭 ELISA 法

　　預先將抗原包被在固相載體上，并加入酶標記的特異性抗體。實(shí)驗時(shí)，加入待檢抗原(或抗體)，如果待檢物是抗原，則待檢抗原與預先包被在固相載體上的抗原競爭結合酶標抗體;如果待檢測物是抗體，則待檢抗體就與系統中原有的酶標抗體競爭結合包被在固相載體上的抗原。通過(guò)洗滌洗掉被競爭結合的酶標抗體，加底物顯色。需要注意的是顯色結果與待檢抗原(或抗體)的量成反比。

　　競爭 ELISA 相對以上介紹的三種方法更復雜一些，但以上三種 ELISA 類(lèi)型都適用于競爭 ELISA  的形式。其主要優(yōu)點(diǎn)在于可檢測不純的樣品，且數據再現性高，但存在整體敏感性和專(zhuān)一性較差的問(wèn)題。

　　ELISA 常見(jiàn)問(wèn)題與解決方法

　　1. 陰性對照出現陽(yáng)性結果

　?、?樣品、試劑被污染，或加樣時(shí)操作不當導致相鄰孔之間溶液濺灑出現交叉污染——更換試劑，小心操作。

　?、?酶標板洗滌不——洗板前先將抗體溶液倒干凈，然后清洗液倒滿(mǎn)板孔，確保能充分洗滌。

　?、?抗體量過(guò)多導致非特異性結合——根據說(shuō)明書(shū)的推薦量使用抗體，稀釋抗體到適當濃度。

　　2.酶標板整體背景高

　?、?抗體非特異性結合——應確保板孔進(jìn)行了封閉并且使用的是恰當的封閉液以防止非特異性結合。

　?、?底物結合濃度過(guò)高——對底物進(jìn)行適當稀釋。

　?、?反應時(shí)間過(guò)長(cháng)——當酶標板顯色足夠進(jìn)行吸光度讀數時(shí)立即使用終止液終止反應，適當縮短顯色時(shí)間。

　?、?底物溶液污染——正常底物溶液應是澄清透明的，若出現黃色或其他顏色表明受到污染，應更換新的底物溶液。

　?、?底物孵育過(guò)程沒(méi)有避光——底物孵育應在避光條件下進(jìn)行。

　　3. 復孔之間重復性差

　?、?樣品數量不整齊，加樣時(shí)間有長(cháng)有短——加重復孔時(shí)盡量保持加樣時(shí)間與接近。

　?、?加樣量不一致——樣品稀釋前應充分混勻，并且使用同一移液槍。

　?、?洗滌條件、操作人員不一致——重復測定樣品時(shí)，操作條件、人員應盡可能與上次保持一致。

　　4. 吸光值偏高或偏低

　?、?樣品中待測抗原含量太低會(huì )導致測定結果偏低——可嘗試增加樣品使用量。

　?、?加入抗體量不合適會(huì )造成結果偏低或偏高——使用建議抗體量或為了使結果更好盡可能調整抗體的用量。

　?、?孵育時(shí)間太短導致檢測結果偏低——適當延長(cháng)抗體或抗原的孵育時(shí)間，確保待測樣品與檢測抗體能充分結合。

　?、?孵育溫度不適合——應抗體在最適宜條件下進(jìn)行孵育(一般 37℃ 孵育 1h )。

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