天津本生詳述PCR技術(shù)原理、實(shí)驗步驟和應用

　　實(shí)驗目的

　　1.掌握聚合酶鏈式反應的原理。

　　2.掌握移液槍和PCR儀的基本操作技術(shù)。

　　二、實(shí)驗原理

　　PCR技術(shù)，即聚合酶鏈反應(polymerasechainreaction，PCR)是由美PECetus公司的KaryMullis在1983年(1993年獲諾貝爾化學(xué)獎)建立的。這項技術(shù)可在試管內的經(jīng)數小時(shí)反應就將特定的DNA片段擴增數百萬(wàn)倍，這種迅速獲取大量單核酸片段的技術(shù)在分子生物學(xué)研究中具有舉足輕重的意義，大地推動(dòng)了生命科學(xué)的研究進(jìn)展。它不僅是DNA分析zui常用的技術(shù)，而且在DNA重組與表達、基因結構分析和功能檢測中具有重要的應用價(jià)值。

　　PCR可以被認為是與發(fā)生在細胞內的DNA復制過(guò)程相似的技術(shù)，其結果都是以原來(lái)的DNA為模板產(chǎn)生新的互補DNA的片段。細胞中DNA的復制是個(gè)非常復雜的過(guò)程。參與復制的有多種因素。PCR是在試管中進(jìn)行的DNA復制反應，基本原理與細胞內DNA復制相似，但反應體系相對較簡(jiǎn)單。

　　PCR由變性--退火--延伸三個(gè)基本反應步驟構成：

　?、倌０錎NA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至94℃左右定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應做準備;

　?、谀０錎NA與引物的退火(復性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合;

　?、垡锏难由欤篋NA模板--引物結合物在Taq酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈。

　　重復循環(huán)變性--退火--延伸三過(guò)程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成個(gè)循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時(shí)就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬(wàn)倍。

　　三、實(shí)驗試劑與器材

　　模板DNA、2.5mmol/LdNTP

　　TaqDNA聚合酶(5U/μL)、SSR引物

　　10×buffer、15mmol/LMg2+、ddH2O

　　PCR儀、移液槍、PCR板

　　四、實(shí)驗步驟

　　1、配制20μL反應體系，在PCR板中依次加入下列溶液：

　　模板DNA2μL

　　引物11μL

　　引物21μL

　　dNTP1.5μL

　　MgCl22μL

　　10×buffer2μL

　　ddH2O10μL

　　Taq酶0.5μL

　　2、設置PCR反應程序。

　　3、上樣，啟動(dòng)反應程序。

　　4、擴增產(chǎn)物的電泳檢測。

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