做ELISA實(shí)驗，這些技巧少不了!

　　介紹：

　　ELISA試劑盒在國內有許多種叫法，例如：ELISA檢測試劑盒、ELISA Kit、酶聯(lián)免疫試劑盒、酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒、酶聯(lián)免疫分析試劑盒、酶免試劑盒等，比較常見(jiàn)的叫法是ELISA檢測試劑盒、酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒等。Elisa生物試驗是一種敏感性高，特異性強，重復性好的實(shí)驗診斷方法。由于其試劑穩定、易保存，操作簡(jiǎn)便，結果判斷較客觀(guān)等因素，已廣泛應用在免疫學(xué)檢驗的各領(lǐng)域中。

　　特點(diǎn)：

　　1.高效、靈敏、特異的抗體。

　　2.穩定的重復性和可靠性。

　　3.吸附性能好，空白值低，孔底透明度高的固相載體。

　　4.適用血清、血漿、組織勻漿液、細胞培養上清液、尿液等多種標本類(lèi)型。

　　5.節省實(shí)驗經(jīng)費。

　　操作方法

　　1.標準品的稀釋?zhuān)埌凑照f(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

　　2.根據待測樣品數量加上標準品的數量決定所需的板條數。每個(gè)標準品和空白孔建議做復孔。每個(gè)樣品根據自己的數量來(lái)定，能使用復孔的盡量做復孔。

　　3. 加樣：不規范的移液操作可能帶來(lái)誤差。

　　1)空白孔，空白對照孔不加樣品，生物素標記的抗NE抗體，鏈霉親和素-HRP，只加顯色劑A&B和終止液，其余各步操作相同;

　　2)標準品孔：加入標準品50ul，鏈霉親和素-HRP50ul(標準品中已事先整合好生物素抗體，故不加);

　　3)待測樣品孔：加入樣本40ul，然后各加入抗NE抗體10ul、鏈霉親和素-HRP50ul，蓋上封板膜，輕輕震蕩混勻，37℃溫育60分鐘。

　　4. 配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用。

　　5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿(mǎn)洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。

　　6. 顯色：每孔先加入顯色劑A50ul，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘。

　　7. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應(此時(shí)藍色立轉黃色)。

　　8. 測定：以空白孔調零，450nm波長(cháng)依序測量各孔的吸光度(OD值)。測定應在加終止液后10分鐘以?xún)冗M(jìn)行。

　　9. 根據標準品的濃度及對應的OD值計算出標準曲線(xiàn)的直線(xiàn)回歸方程，再根據樣品的OD值在回歸方程上計算出對應的樣品濃度。也可以使用各種應用軟件來(lái)計算。

　　洗板方法

　　一、手工洗板方法：

　　甩掉酶標板內的液體;在實(shí)驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次;將稀釋后的洗滌液至少0.35ml注入孔內，浸泡1-2分鐘。根據需要，重復此過(guò)程數次。

　　二、自動(dòng)洗板：

　　如果有自動(dòng)洗板機，應在熟練使用后再用到正式實(shí)驗過(guò)程中。

　　注意事項

　　1.從2-8℃取出的試劑盒，在開(kāi)啟試劑盒之前要室溫平衡至少30分鐘。酶標包被板開(kāi)封后如未用完，板條應裝入密封袋中保存。

　　2.各步加樣均應使用加樣器，并經(jīng)常校對其準確性，以避免試驗誤差。

　　3.嚴格按照說(shuō)明書(shū)的操作進(jìn)行，試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準。

　　4.為避免交叉污染，要避免重復使用手中的吸頭和封板膜。

　　5.不同批次試劑盒不能混用，如遇試劑不夠，請及時(shí)聯(lián)系客服解決

　　6.底物B對光敏感，避免長(cháng)時(shí)間暴露于光下。

　　7.中、英文說(shuō)明書(shū)或許會(huì )有不一致之處，請以英文說(shuō)明書(shū)為準。

　　8.保存溫度：2-8℃。

　　9.有效期：6個(gè)月(2-8℃)。

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